style="width:6.04003in;height:1.95338in" /> 本文是学习GB-T 33115-2016 水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了水仙迟季黄化病毒(Narcissus late season yellows
virus)的检疫鉴定方法。
本标准适用于可能携带水仙迟季黄化病毒的水仙及水仙产品检疫鉴定。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样
SN/T 2964 植物病毒检测规范
SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范
中文名：水仙迟季黄化病毒。
学名：Narcissus late season yellows virus,缩写：NLSYV。
分类地位：马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae),马铃薯 Y 病毒属(Potyvirus)。
水仙迟季黄化病毒的其他信息参见附录 A。
水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。
高速冷冻离心机、电子天平、PCR 仪、荧光PCR 仪、水平电泳系统、
-20℃低温冰箱和一80℃超低 温冰箱、凝胶成像分析系统、pH
计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶标
仪等。
酶联板、可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)和可调移液器头、离心管、研
钵等。
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682 中相关规定。
PTA-ELISA 检测
GB/T 33115—2016
试剂见附录 B;RT-PCR 检测试剂见附录 C;实时荧光RT-PCR 检测试剂见附录 D。
抽样方法按照SN/T 2122 中规定执行。
分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照SN/T 2964 和 SN/T
3457中规定执行。
以含 NLSYV 材料作为阳性对照，以不含 NLSYV
的健康植物组织作阴性对照，同时以样品提取缓
冲液作为空白对照，具体操作见附录 B。
以含 NLSYV 材料作为阳性对照，以不含 NLSYV
的健康植物组织作阴性对照，同时以ddH₂O 代
替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA, 反转录合成cDNA 后进行 PCR
检测，具体操作
见附录 C。 如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。
以含 NLSYV 材料作为阳性对照，以不含 NLSYV
的健康植物组织作阴性对照，同时以 ddH₂O 代
替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA, 进行实时荧光RT-PCR
检测，具体操作见附录
D。 如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：
——PTA-ELISA 初步筛检，若检测结果为阴性，则判定样品不携带 NLSYV;
若检测结果为阳性，
则采用RT-PCR 或实时荧光RT-PCR 方法进行验证。
——若验证结果为阳性，则判定样品携带 NLSYV;
若验证结果为阴性，则判定样品不携带
NLSYV。
经检测确定携带 NLSYV
的样品应保存在适合的条件下以备复核。种苗、叶片等样品保存在
-80℃冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少6个月。
记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。
PTA-ELISA 检测应有酶联反应数值；RT-PCR 检测应有电泳图片；实时荧光RT-PCR
检测应有实时荧光结果图片。
GB/T 33115—2016
(资料性附录)
水仙迟季黄化病毒相关资料
A.1 寄主范围
寄主范围较窄，已报道的寄主为水仙(Narcissus tazetta L.)。
A.2 病害症状
侵染水仙后引起叶片、花茎上出现窄长的褪绿条纹或椭圆状斑块等症状(参见图
A.1)。
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图 A.1 NLSYV 侵染水仙后引起的症状
A.3 分布地区
主要分布于英国、荷兰、新西兰、中国等国家。
A.4 传播途径
主要由桃蚜(Myxus persicae)传播。
A.5 粒体形态
病毒粒体为线条状，大小约750 nm×12 nm(参见图 A.2)。
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注： 引自 http://www.dpvweb.net。
图 A.2 NLSYV 病毒粒体
GB/T 33115—2016
A.6 病毒基因组
正义单链 RNA 病毒，全长约9651 bp。
GB/T 33115—2016
(规范性附录)
酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA)
B.1 试剂
B.1.1 包被缓冲液(pH 9.6)
碳酸钠(Na₂CO₃) 1.59 g
碳酸氢钠(NaHCO₃) 2.93 g
叠氮化钠(NaN₃) 0.2 g
加入蒸馏水900 mL, 用 HCl 调节 pH 值到9.6,然后加蒸馏水至1 L,4℃ 储存。
B.1.2 磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)
氯化钠(NaCl)
磷酸二氢钾(KH₂PO₄)
磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)
氯化钾(KCl)
叠氮化钠(NaN₃)
加入900 mL 蒸馏水溶解，用NaOH
或 HCl 调节pH 值到7.4,然后加水至1 L。
B.1.3 PBST
每升 PBS 中加入0.5 mL 的吐温-20。
B.1.4 抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液
三羟基氨甲烷盐酸盐(Tris-HCl)
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
氯化钠(NaCl)
吐温-20(Tween-20)
脱脂奶粉
加入蒸馏水定容至1 L,4℃ 储存。
B.1.5 底物(pNPP) 缓冲液(pH9.8)
氯化镁(MgCl₂)
叠氮化钠(NaN₃)
二乙醇胺[HN(CH2CH ·OH)。]
溶于800 mL 蒸馏水中，用 HCl 调节pH
B.1.6 抗体
值至9.8,蒸馏水定容至1 L,4℃ 储存。
病毒抗体：水仙迟季黄化病毒抗体。
酶标抗体：碱性磷酸酶标记羊抗兔 IgG。
GB/T 33115—2016
B.2 操作步骤
B.2.1 样品制备
称取0.5 g～1.0g
待测样品，按1:10(质量：体积)比例加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆， 8000g
离心5 min,
上清液即为制备好的检测样品，保存于-20℃冰箱。阴性对照、阳性对照作相应的
处理或按说明书进行。
B.2.2 包被抗原
加入制备好的检测样品，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。每个处理至少设2个重复。
100μL/ 孔，37℃孵育1 h 或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，用PBST
洗涤4次～6次。
B.2.3 加病毒抗体
将病毒抗体按说明稀释至工作浓度，加入到酶联板的孔中，100μL/孔，37℃孵育1
h,倒去酶联板
孔中溶液，用PBST 洗涤4次～6次。
B.2.4 加酶标抗体
将酶标抗体按说明将稀释至工作浓度，加入到酶联板的孔中，100μL/孔，37℃孵育1
h,倒去酶联
板孔中溶液，用PBST 洗涤4次～6次。
B.2.5 加底物
将底物pNPP 加入到底物缓冲液中使终浓度为1 mg/mL (现配现用),按100μL/
孔，加入到酶联板
中，室温避光孵育
B.2.6 吸光值的测定
阳性对照孔显色后，用酶联仪于405 nm 处读 OD 值。
B.3 结果判断
在满足阴性对照孔的 ODos 值\<0.15、阳性对照孔的 ODos 值/阴性对照孔的 ODos
值>5～10,孔的 重复性基本一致的质量要求后，样品 OD 值/阴性对照 ODs
值>2,判为阳性。样品 ODos 值/阴性对 照 ODos
值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。样品
ODos 值/阴性对
照 ODos 值\<2,判为阴性。
GB/T 33115—2016
(规范性附录)
RT-PCR 检测
C.1 试 剂
C.1.1 TRIzol 裂 解 液 。
C.1.2 5×TBE 缓 冲 液 ：
Tris 碱
硼酸(H₃BO₃)
0.5 mol/L EDTA(pH8.0)
补充蒸馏水至1 L。 用时加蒸馏水稀释至0.5×TBE。
C.1.3 三氯甲烷。
C.1.4 异 丙 醇 。
C.1.5 75% 乙 醇 。
C.1.6 无水乙醇。
C.1.7 RT 缓 冲 液 。
C.1.8 dNTPs:10 mmol/L。
C.1.9 M-MLVRT:200 U/μL。
| C.1.10 |
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|---|---|
| C.1.11 |
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| C.1.12 |
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| C.1.13 |
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C.1.14 引物序列：
根据已报道的 NLSYV 基因组序列设计1对用于特异性扩增的引物：
NLSYVf:5'-CCACTTGAAGTCTATCACCA-3'
NLSYVr:5'-CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3'
PCR 产物大小938 bp。
C.2 RT-PCR 检 测
C.2.1 总 RNA 提 取
取0.1 g 样品组织置于研钵中，加入1 mLPBST 缓冲液研磨，4℃,10000 g 离心5
min,取上清液 (100μL～200μL)迅速转移至灭菌的1.5mL 离心管中，并加入1
mLTRIzol 试剂，剧烈振荡后，室温静 置5 min;4℃,12000g 离心10
min,取上清液；加入三氯甲烷300μL,剧烈振荡15 s,室温静置5 min, 4℃,12000g
离心15 min,取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15
min,4℃, 12000g 离心10 min,弃上清液；加入1 mL75%
乙醇洗涤沉淀2次，每次4℃,7500 g 离心3 min,弃 上清液；RNA
沉淀干燥后，用20μL～40μL 经 DEPC (焦碳酸二乙酯)处理过的ddH₂O 溶解，
-20℃保
存备用。
GB/T 33115—2016
C.2.2 cDNA 合 成
在 PCR 管中加入2μL 总 RNA,1μL 下游引物 NLSYVr(10
μmol/L),ddH₂O5μL,70℃水浴
10min, 迅速冰浴5 min, 再加入下列试剂：5× RT 缓冲液2.5 μL、dNTPs(10
mmol/L)1 μL、M- MLVRT(200 U/μL)0.5μL、RNA 酶抑制剂(40
U/μL)0.5μL。42℃水浴60 min,70℃水浴10 min, 自
然冷却至室温， 一20℃保存备用。
C.2.3 PCR 扩 增
PCR 反应体系见表C.1,每个反应设置2个重复。
PCR 反应条件：94℃预变性3 min,然后94℃变性30 s、56℃ 退火45 s、72℃延伸1
min,35 个循
环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10 min。
表 C.1 PCR 反应体系
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|---|---|
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| 25 mmol/L MgCl₂ |
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C.2.4 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
C.2.4.1 阴性对照：不含病毒的健康植物组织。
C.2.4.2 阳性对照：含有 NLSYV 材 料 。
C.2.4.3 空 白 对 照 ：ddH₂O。
C.2.5 琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶，对 PCR 产物进行电泳。电泳结束后，在溴化乙锭 (EB,
浓度为 0.5μg/mL)
溶液染色10min,再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA
电泳带，拍照并
做记录。
C.2.6 结果判断
如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，阳性对照在938 bp
大小处有扩增条带，待测样品出现与
阳性对照一致的扩增条带，则判定为阳性。
如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，阳性对照在938 bp
大小处有扩增条带，待测样品未出现
与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阴性。
GB/T 33115—2016
(规范性附录)
实时荧光 RT-PCR 检测
D.1 试 剂
核酸提取、反转录试剂同C.1。
D.2 引物及探针
实时荧光 RT-PCR 检测引物及探针见表D.1。
表 D.1 实时荧光 RT-PCR 检测引物及探针
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|---|---|
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D.3 总 RNA 提取
方法同C.2.1。
D.4 cDNA 合成
方法同 C.2.2。
D.5 实时荧光 PCR 反 应
实时荧光 PCR 反应体系见表 D.2, 每个反应设置2个重复。
反应程序：95℃ 30 s;95℃5s,60℃ 34 s,共40个循环。
表 D.2 实时荧光 PCR 反应体系
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|---|---|
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GB/T 33115—2016
D.6 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
D.6.1 阴性对照：不含病毒的健康植物组织。
D.6.2 阳性对照：含有 NLSYV 材料。
D.6.3 空白对照：ddH₂O。
D.7 结果判定
在空白对照及阴性对照无 Ct 值且无扩增曲线、阳性对照 Ct
值≤30并出现典型扩增曲线的条
件下：
——待测样品的Ct 值>40时，判定 NLSYV 阴性；
——待测样品的Ct 值\<35时，判定 NLSYV 阳性；
—— 待测样品的35≤Ct 值≤40时，应重新进行测试；如果重新测试的 Ct
值≥40时，判定 NLSYV
阴性；如果重新测试的Ct 值\<40,则判定 NLSYV 阳性。
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